建安十三年（208年），丞相曹操南征，大败左将军、豫州牧刘备。曹操占领江陵后，给孙权写信，直意要取下东吴之地。孙氏阵营内部分化为主战、主和两派，主战派以鲁肃、周瑜为代表，主和派以张昭为代表。张昭在当时影响力很大，但孙权却有意与曹操一战。此时，鲁肃从江夏带来刘备的谋士诸葛亮，表明刘备联孙抗曹的决心。周瑜及时返回，说明曹操的种种弊端，战有望获胜。孙权果断决定，以周瑜、程普为左右都督，与刘备合兵，和曹操决战。周瑜用黄盖之谋，以五万人于赤壁大破曹操军。战后，刘备、周瑜等又追击至南郡，曹操只好撤回北方，留曹仁、徐晃在江陵，派乐进镇守襄阳。
此时，甘宁在夷陵被曹仁包围，周瑜采纳吕蒙的计策，留下凌统抵御曹仁，以一半兵力驰救甘宁，获胜而返。同年，孙权亲率大军围困合肥，派张昭攻打九江郡的当涂县。张昭出兵不利，孙权攻合肥亦未能破城，最后只得退兵。建安十四年（209年），周瑜与曹仁相持已有一年多的时间。曹仁的军队死伤众多，最终弃城逃走。孙权得南郡后，任命周瑜为南郡太守。同年，刘备上表奏封孙权代理车骑将军，兼任徐州牧。孙权与刘备在京口相见，并同意借南郡等予刘备。二人此次会面，巩固了孙刘联盟。曹操为防范孙权，强制内迁淮南的民众，引发江淮十余万户百姓惊慌，使其尽皆渡江归附孙权。
